一、H1N1小鼠模型構(gòu)建動物選擇

1. 常用品系

• BALB/c小鼠：對H1N1敏感，免疫應(yīng)答強(qiáng)（Th2偏向），適合疫苗研究。

• C57BL/6小鼠：Th1應(yīng)答優(yōu)勢，適合免疫機(jī)制研究。

• DBA/2小鼠：對部分H1N1毒株高度易感，可致重癥肺炎。

2. 年齡與體重：6-8周齡（18-20g），避免年齡差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差。

3. 飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級設(shè)施，控制溫濕度（22±2℃，50%濕度）。

二、H1N1小鼠模型構(gòu)建病毒準(zhǔn)備

1. 毒株選擇

• 實驗室常用株：A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1, PR8)、A/WSN/1933 (H1N1, WSN)。

• 臨床分離株：需通過MDCK細(xì)胞或雞胚傳代適應(yīng)小鼠。

2. 病毒擴(kuò)增與滴定

• 在MDCK細(xì)胞或雞胚尿囊腔中增殖，測定TCID??或PFU（空斑形成單位）。

• 儲存：分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

三、感染流程

1. 麻醉與接種

• 麻醉：吸入異f烷（3%誘導(dǎo)，1.5%維持）或腹腔注射戊巴b妥鈉（50mg/kg）。

• 接種途徑：

• 鼻內(nèi)接種（常用）：小鼠仰臥，垂直滴注病毒液（30-50μL/只，含1×103~10? PFU）。

• 氣管內(nèi)接種（需手術(shù)暴露氣管）：精準(zhǔn)遞送至下呼吸道，適用于重癥模型。

2. 劑量優(yōu)化（以PR8為例）

• 亞致死感染：1×103 PFU（用于免疫研究）。

• 致死性感染：5×10? PFU（生存率分析）。

3. 對照設(shè)置

• 陰性對照：PBS或未感染細(xì)胞上清。

• 滅活病毒對照：紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活病毒。

四、感染后監(jiān)測與評估

1. 臨床評分

• 體重下降：每日稱重，下降>20%為人道終點。

• 癥狀評分（0-5分）：

• 0分：無癥狀；1分：豎毛；2分：活動減少；3分：呼吸困難；4分：瀕死狀態(tài)。

2. 病毒學(xué)檢測

• 肺組織病毒載量：

• 處死后取肺，勻漿后通過qPCR（檢測NP基因）或噬斑試驗（PFU/g組織）。

• 鼻腔沖洗液：監(jiān)測上呼吸道病毒脫落。

3. 病理分析

• 肺組織HE染色：評估炎癥（肺泡壁增厚、浸潤）、出血、壞死。

• 免疫組化：檢測病毒抗原（如NP蛋白）分布。

4. 免疫應(yīng)答分析

• 細(xì)胞免疫：流式檢測肺內(nèi)CD8? T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（如CD11b?F4/80?）。

• 體液免疫：ELISA檢測血清IgG/IgA（針對HA或NP蛋白）。

五、注意事項

1. 生物安全：

• H1N1為BSL-2病原體，操作需在二級生物安全柜中進(jìn)行，廢棄物高壓滅菌。

2. 劑量驗證：

• 預(yù)實驗確定毒株的LD??（半數(shù)致死量），避免過度感染導(dǎo)致快速死亡。

3. 時間節(jié)點：

• 急性期：感染后3-5天（病毒復(fù)制高峰）；

• 恢復(fù)期：7-14天（免疫應(yīng)答高峰）。

4. 倫理終點：

• 體重下降>20%、嚴(yán)重呼吸困難或無法進(jìn)食時需人道處死。